微流控系统

 　　简单的并行迭片微混合器是T型和Y型微混合器。这类简单的微混合器，需要比较长的混合通道，单纯用于混合效果较差，一般用于研究微尺度下传递现象，如放大（缩小）法则、蝴蝶效应，以及其它非线性现象。

　　为了进一步增强混合效果，可以采用流动聚焦或3D交互式设计的方法缩短混合距离。其基本的设计如下图所示。
 

　　上图（a）所示的流动聚焦式混合器主要采用有三个进样口的长微通道，中间的入口加样品，两侧入口加溶剂，三股液流在主通道交汇，两侧的溶剂流起到鞘流的作用将中间的样品流聚焦成一窄带，降低了样品流的宽度，缩短了混合距离。利用这种设计，混合时间可以缩短至几个毫秒。
 　　下图所示的是3D交互式的并行迭片微混合器，中间为硅片通道，上下层为玻璃盖片。其混合过程如下：液流 A 在第一层的输入管道被重复对称切分为16个支流，液流的各部分从头到尾流经这些支管道及整个系统时通过的距离相同。在微混合器的另一层上，液流 B 也同时按上述方式被切分，然后通过一系列夹层孔与第一层相通，终以垂直的方式与液流 A 混合，即相同数目的支流重新合并为一体。

  　　3.2 串联迭片微混合器

　　串联迭片微混合器是指入口两流体首先在水平状态形成一股流体流动，然后被垂直分割，再水平汇合，垂直分割，如此重复，经过m次汇合和分割后，则会出现2m层薄层流体，能够使混合时间减小4m-1倍。其过程如图所示。
 

 　　3.3 混沌对流微混合器

　　混沌对流微混合器对混合微通道内部或外部结构进行了一定形式的修正，使流体层发生分割、拉长、折叠和破裂等现象，以强化混合过程。

　　适用于不同的雷诺数范围的混沌对流微混合器如图所示。

　　（a, b）所示结构是在混合通道的管壁或内部设置障碍物，不断改变流体方向来增强横向传质，以产生混沌对流。例如将7个直径为10 μm 的圆柱体排列于50 μm × 100 μm × 100 μm 的混合室中增强混合，混合时间仅需50 μs[5]。这种混合器适用的雷诺数范围为200-2000。

　　（c）中Z形通道产生混沌对流的主要原因是在高雷诺数时流体在弯道处发生回流。以宽100 μm，高48 μm，长2 mm的Z形通道为模型进行模拟分析[6]，结果发现在Pe 值固定为2600，雷诺数低于80时，混合过程主要依靠扩散；雷诺数高于80时，混合由于流体在弯道处发生的回流而增强。
 

 　　（a）所示为2D平面修改的Tesla结构。这种结构依靠科安达效应产生混沌对流，显著改善混合效果。这种混合器混合效果在雷诺数大于5时比较好。（b）中3D蛇形的混合通道是由一系列相互垂直的C型片断组成，适用的雷诺数范围为25-70。
 

 　　基于（a）的设计，用脉冲紫外准分子激光器（KrF，248 nm）在聚碳酸酯T型微通道交汇处烧蚀出一组倾斜的凹槽，借以增强横向运送，使液流在电渗流作用下快速混合。在0.06 cm/s的流速下，混合效率可达到75％；但在高流速下，混合效率差别较大（在0.81 cm/s的流速下，混合效率45-80％不等）。当流速为0.81 cm/s时，在有混合器存在的情况下，443 μm的T型微通道即可达到80%的混合；而没有混合器存在的情况下，仅依靠分子扩散则需要2.3 cm的T型微通道才能达到相同的混合效果。
 

 　　(a)微混合器通道结构明场图像。T型微通道内刻有一系列凹槽，距离主通道183 μm的凹槽后的虚线代表荧光检测点；不同流速下电渗流通过混合器的荧光图像：(b) 0.06 cm/s；(c) 0.81 cm/s；(d) 没有凹槽的T型微通道结构图像和不同流速下电渗流通过T型微通道的荧光图像：(e) 0.06 cm/s； (f) 0.81 cm/s

　　基于（b）的设计，研究者在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上加工出底部置有错排人字形的二维微通道，如下图所示。由于通道底部修饰的特殊结构，流体在通道中心处发生拉伸和折叠，引起混沌对流，从而提高混合效率。该系统可用于微通道内稳定压力驱动的低雷诺数液体的被动混合。
 

 　　3.4 液滴式微混合器

　　液滴式微混合器将待混合的两种液体和夹在它们中间阻隔其提前接触的惰性液体一同流入不互溶的油性液体中形成液滴，在液滴内部实现混合。混合的两种液体在液滴内依靠湍流快速混合反应（2 ms），而且在流动过程中没有弥散现象。利用液滴式微混合器，可以实现微秒级化学反应。

 　　4.2 声场促进型微混合器

　　气泡引发的声场微混合器如下图所示。在这种混合器中，压电盘被置于反应池背面，一系列符合大小要求的气泡被引入待混合溶液。流体试验表明，由声场引发的稳定循环流使停留在固体表面的气泡产生震动，从而形成球形对流，加速混合过程。采用这种方法，混合22 μL溶液的时间可由几个小时（基于扩散的混合）减少到几十秒。

　　另一种以声场为外力的主动混合方法是超声振动。由于锆钛酸铅（PZT）具有较高的机电耦合系数，因此往往被选作超声振动的激发源。下图中，混合器芯片上有两个单独的混合器，每个混合器由两个入口和一个出口。集成在微混合器背面的PZT超声波辐射装置在48 kHz 的方波（峰间距150 V）激发下产生超声波，引起振动膜振动，使原本分层流动的乙醇层流（115 μL/min）和水层流（100 μL/min）变得不稳定，在7 s后发生高效混合。超声振动混合具有较高的混合效率，但超声会引起局部温度升高，因此不适合于生物样品。

　　4.3 电场促进型微混合器

　　电场促进型微混合器的驱动力可以是电动力、电渗或介电力等。下图所示的可变电渗流驱动的T型混合器利用可变直流电场产生电渗流，同时驱动并混和液体样品。具体涉及两种操作模式，即传统切换模式和新型抑制切换模式。传统切换模式下，驱动电压轮流施加在两个通道上，当一个通道有电压时，另一通道悬空。两个进样通道的液体轮流进入混合通道。该模式增加了液流的不稳定性，加大了接触面积，增强了扩散。抑制切换模式下，循环切换电压过程中用一组电阻器产生抑制电压。在抑制电压作用下，液体不仅进入了混合通道，而且有一部分进入另一进样通道。当电场方向改变时，先前进入进样通道的液体会被扰动。因此，抑制切换模式能够产生连续大幅波动，混合效果更好。这种方法能够同时在同一通道注入并混合样品，操作简便。在抑制切换模式下，采用60 V/cm驱动电压，2 Hz切换频率进行T型进样，1 mm混合距离即可达到97%的混合效率。

　　微混合技术已经显示出以下几个特点：

　　1. 混合效率高，混合时间短，能耗少。

　　2. 易于控制，传质及传热性能好。

　　3. 设备结构简单，容易与其他功能单元集成。

 　　> 和测序芯片若即若离

　　从广义上来说，一切将生物/化学实验微型化的尝试，都和微流控搭点边。

　　为了实现高通量和低成本，NGS技术必然需要在微型化方面作文章。因此，从商品化NGS系统，即454测序仪身上，就能看出多重微流控的身影。

　　首先是Microwell芯片，被称作微坑、微井或微孔芯片，其实就是一种微型孔板。孔板是生物实验中经常用到的反应容器，但即使是1536孔板，每孔体积也有10微升左右，孔径在2～3 mm，未能进入微型化范畴。把尺寸进一步地减小，小到几微米至几百微米的水平，就是微流控技术领域中典型的Microwell型芯片了。

　　这类芯片可以用基础的半导体加工技术来制作。将光胶作为牺牲层，先覆上掩模、进行光刻，形成图案以后，再利用光胶层的保护作用，对基底进行刻蚀。最后去除残留的光胶，得到微坑结构。

　　微流控领域还经常用到一种叫做“软光刻”（Soft lithography）的加工技术。用光胶首先在基底上加工出微柱结构，即微坑的反结构，作为模具。然后把一种高分子聚合物，聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）浇于其上，加热固化以后，再把它从模具上剥离，即得到PDMS微坑阵列芯片。这种方案中的微柱模具几乎可以使用，减少了繁琐的光刻和刻蚀步骤，简化了加工流程，但PDMS本身有一些缺点，一般只适合小作坊式的实验室使用。

 　　454测序所采用的微坑尺寸也在微米级。它的加工方法就是古老的湿法刻蚀，只不过不是在普通的玻璃，而是切割成薄片的光纤上进行。

　　传统测序反应在离心管或孔板中开展，454测序反应则发生在体积约为84 pL的微坑之中。试剂省了，规模上去了，目标自然也就达到了。
 

　　不过，此类芯片缺乏微流控特色，只有“微”，几乎没有“流”和“控”。在微坑阵列芯片上均匀地铺上微球悬液，微球就会自己落入微坑。一个微球一个坑，只涉及到了微球自身的重力作用。也因为“控制”的成分不多，简单易用，使用门槛低，当人们想用微流控相关技术来实现某种微型化生化分析时，容易想到的便是微坑阵列芯片。
 

 　　随着454黯然落幕，Illumina强势登场，NGS测序芯片一度和微流控没什么关联。早期的流动槽除了泳道这种宏观结构以外，不具备精细的微纳结构。桥式扩增后形成的Cluster在泳道底面上是随机分布的，所以当时的Illumina测序还需要优化Cluster密度。如若密度太高，相邻的Cluster之间会相互重叠；密度太低则导致数据产出效率低下。

　　有趣的是，随后Illumina便推出了图案化流动槽（Patterned flow cell），其泳道中包含Nanowell阵列。Nanowell比Microwell更微小，单个Nanowell孔径大约为几百纳米。寡核苷酸引物被选择性地修饰在纳米井内，使扩增后形成的Cluster呈阵列化分布。Nanowell是什么样儿，那些Cluster就分布成什么样儿。

　　Nanowell对Cluster产生的空间限制，使Cluster的排列更规则，同时避免了Cluster重叠问题，让流动槽芯片实际能够达到的Cluster密度上了一个台阶。也就是说，此举进一步地提高了单位时间内的数据产量，提升了测序效率。
 

 　　> 与单细胞测序难舍难分

　　如同单细胞测序是如今测序行业的一个分支，液滴微流控也是微流控技术的一大分支。

　　什么是液滴微流控技术呢？

　　别急，我们先回到刚才提到的454测序，细数第二项微流控相关技术，乳液PCR。

　　乳液有水包油、油包水、油包水包油等各种类型，而乳液PCR通常是油包水型。油相中分散着无数微小的液滴（Droplets），让它整体呈现乳白色。

　　1998年，Tawfik和Griffiths在Nature Biotechnology上发表文章，以乳液的形式开展基因修饰与分子进化分析。他们认为，这种内含基因片段和反应物的小液滴与细胞本身相似，并称之为细胞样区室（Cell-like compartments）。细胞膜围裹细胞器和各类生物分子，类比到液滴上，就是油-水界面包裹着生化反应。

　　当时的乳液制作方法十分粗暴，就是搅拌。一边搅拌，一边往含有表面活性剂的矿物油中倒入DNA与试剂的混合溶液，这样产生的液滴尺寸很不均匀。

　　2001年，Quake研究组利用T型微通道生成尺寸均一的液滴，这才与微流控之间产生了现实与命运的交织。
 

　　乳液PCR有什么好处呢？这得从液滴微反应器的特征说起。

　　与前面提到的微坑阵列相似，液滴其实也是一种微型反应容器。它是柔性的，既可以是静态的，也可以是流动的。不同于微坑的固相容器壁，液滴与油相之间的球状界面就是天然的液体屏障，能够避免液滴中的成分外泄，使每个液滴都是独立的微反应器（Microreactor）。生成液滴的过程往往非常快速，适于开展大规模、高通量生化分析。
 

　　对于PCR而言，当液滴足够地多，模板DNA被稀释到一定程度时，就能让每个液滴里最多只含有一条DNA分子。于是，在每个液滴围拢成的微型世界里，所有的资源都向这个DNA倾斜，不存在恶性竞争，整体的扩增情况就更为均匀。进一步地把乳液PCR升级为数字PCR，还能实现核酸分子的绝对定量。

　　同样的原理也适用于单细胞捕获。稀释细胞悬液，使其生成液滴，细胞便会在液滴里随机分布。如果控制得好，部分液滴能恰好捕获到一个细胞。现在主流的单细胞测序系统很多都是这个路数。